基因–代谢物–通路网络：完整技术报告

主要发现：全局网络含 10 条通路、88 个基因、15 个代谢物和 240 条 30 样本高相关边；扣除组别后（组内相关）仍显著的配对，45 个比较合计只有 18 对。

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1 分析目的

联合富集只说明哪些通路同时有两组学的差异分子，相关分析只说明哪些分子对共变，二者分开看时难以回答“这条通路里，哪些基因和哪些代谢物在一起变化”。三层网络把基因、代谢物和通路放在一起：通路注释告诉我们分子属于哪条通路，相关边告诉我们哪些分子在样本中同步变化，两者叠加可以找到通路内有统计支持的基因–代谢物对，作为后续验证的候选。

2 分析原理

节点：基因（Gene）、代谢物（Metabolite）、KEGG 通路（Pathway）三种。

两类边，严格区分：

注释边（灰色虚线）：基因–通路（基因经 KO 注释到该通路）、代谢物–通路（代谢物经 KEGG 化合物编号注释到该通路）。只表示 KEGG 注释，不是统计关联；两个分子注释到同一通路，不代表它们相关。
相关边（红色为正、蓝色为负，粗细为 |r|）：基因–代谢物 Pearson 相关，系数来自这一对分子本身，不使用通路级的系数。

相关的三种口径（分开保存，不混用）：

全部样本 r（r_all）：30 个样本，代谢物未检出的样本不参与；P 按实际参与样本数 n 用 t 分布计算（df = n − 2）；FDR 为相关性分析中“该比较全部差异基因 × 差异代谢物配对”内的 BH 校正。
校正组别 r（r_within）：每个分子先减去所属组（10 组）的组均值，再求相关，排除处理和水平造成的共同变化；df = n − 组数 − 1；FDR 范围同上。
本比较 6 样本 r（r_cmp）：只用该比较的 6 个样本，6 样本中有未检出时不计算；FDR 在该比较全部配对内 BH 校正。6 个样本分两组，r_cmp 主要反映组间差异。

入选规则：每个比较取 KEGG 联合富集中共映射通路，按 Fisher 合并 P 取前 10 条；基因和代谢物为注释到这些通路的该比较差异分子；相关边为这些基因 × 代谢物的全部配对，并标出各口径是否通过阈值（r_all：|r|≥0.8 且 FDR<0.05；r_within：FDR<0.05；r_cmp：|r|≥0.8 且 FDR<0.05）。全局网络取在最多比较中联合显著的 10 条通路，分子为注释到这些通路、在任一比较差异、且有全局高相关配对的基因和代谢物，相关边为全局高相关配对（附组内相关）。

图的布局：三列分层布局，左列基因、中列通路、右列代谢物；节点大小为通过阈值的相关边数。静态图（PNG / PDF / SVG）只画通过 r_all 阈值的边，Tier1 优先、按 |r| 取前 150 条；网页交互网络可切换三种口径并按通路、显著性、相关强度筛选，一次最多显示 800 条相关边。

3 输入数据及预处理

第 05 步每个比较的 KEGG 联合富集结果（共映射通路和 Fisher 合并 P）；第 01 步的通路–基因、通路–代谢物注释；第 08 步的全局相关矩阵（r_all、r_within 及自由度）、每个比较的全部配对表（FDR、r_cmp）和全局高相关配对；差异基因、差异代谢物及其 log2FC。代谢物未检出值不参与相关计算，不填补。

4 软件、算法及参数

软件 / 函数	版本	用途与关键参数
R / data.table	4.4.3 / 1.18.6.1	节点表、边表构建；P 值按 t 分布由 r 和自由度计算
ggplot2 / svglite	4.0.3 / 2.2.2	三层网络静态图（PNG / PDF / SVG）
网页交互网络	—	报告自带脚本（不依赖网络），分层布局；搜索、缩放、拖动、点击查看节点详情；导出当前视图为 SVG
参数	—	每个比较 10 条通路；静态图最多 150 条边；网页最多 800 条边

5 统计指标解释

下表列出本页出现的全部统计指标和缩写（由页面内容自动生成）。全部术语见术语表。

术语	中文名	英文名	定义与读法
log2FC	以 2 为底的倍数变化对数	log2 fold change	两组均值之比取 log2。本报告统一为 log2(后一组/前一组)，比较名 A_vs_B 中 B 为后一组；log2FC=1 表示后一组是前一组的 2 倍，-1 表示一半。基因的 log2FC 来自服务商 DESeq2 结果；代谢物为两组原始强度均值之比。两组都未检出时没有 log2FC（记为 NA，不是 0）。
P	P 值	P value	在原假设（无差异、无相关或无富集）成立时，得到当前或更极端结果的概率，未经多重检验校正。
FDR	错误发现率	false discovery rate	多重检验校正指标，表示在所有判为显著的结果中，预期假阳性所占比例。本报告全部用 Benjamini–Hochberg 方法计算，检验范围在各分析中分别说明（如“该比较的全部配对”“全部可评估通路”）。
BH	Benjamini–Hochberg 校正	Benjamini–Hochberg procedure	把 m 个 P 值从小到大排序，第 i 个的校正值为 min(1, min_{k≥i} P_(k)·m/k)。控制 FDR，比 Bonferroni 校正宽松。
NA	缺失值	not available	没有数值。未检出、未检验或不可计算时记为 NA，不当作 0。
r	相关系数	correlation coefficient	本报告中未特别说明时指 Pearson 积矩相关系数，范围 −1 到 1；正值表示同涨同落，负值表示此消彼长，绝对值越大线性关系越强。
Pearson	皮尔逊相关	Pearson correlation	r = Σ(x−x̄)(y−ȳ) / √[Σ(x−x̄)²·Σ(y−ȳ)²]，衡量线性关系。显著性用 t = r·√[df/(1−r²)] 服从自由度 df 的 t 分布检验。
r_all	全样本相关	correlation across all samples	30 个样本上的 Pearson r（代谢物未检出的样本不参与），包含组间差异和组内个体差异两部分。
r_within	组内相关	within-group correlation	每个分子先减去所在组（10 组）的组均值，再对残差求 Pearson r。它只反映组内个体之间的共变，等价于以分组为协变量的偏相关。自由度 = 样本数 − 组数 − 1。
r_cmp	比较内相关	correlation within one comparison	只用该比较的 6 个样本计算的 Pearson r，6 样本中有未检出时记为 NA，只作对照。
df	自由度	degrees of freedom	相关检验中为 n−2（n 为参与计算的样本数）；组内相关为 n − 组数 − 1。
Tier1	一级证据配对	Tier 1 pair	\|r_all\|≥0.8 且 FDR<0.05，同时组内相关 FDR<0.05 且与 r_all 同号。说明两者的关联在扣除组间差异后仍存在。
KEGG	京都基因与基因组百科全书	Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes	代谢通路和分子功能数据库。本流程用 KEGG 通路、KO、化合物（C 编号）和反应（R 编号）注释。
KO	KEGG 直系同源编号	KEGG Orthology	K 开头的编号，把不同物种的同功能基因归为一类，用于把基因映射到通路。
Fisher	Fisher 合并 P 值	Fisher's method	X² = −2(ln P_gene + ln P_met)，在两 P 值独立且原假设成立时服从自由度 4 的卡方分布，用于把两组学的证据合成一个 P。
co-mapped	共映射	co-mapped	某比较中一条通路同时含有差异基因和差异代谢物。
DFR	二氢黄酮醇 4-还原酶	dihydroflavonol 4-reductase	K13082，把二氢黄酮醇还原为无色花色素，是花色素和原花青素分支的入口。
LDOX	无色花色素双加氧酶	leucoanthocyanidin dioxygenase	又称花色素合酶（ANS），K05277，把无色花色素转化为花色素。

6 图表与结果展示

全局结果

基因–代谢物–通路交互网络（全局）节点表边表

目的: 在全部样本层面交互查看重点通路中的基因–代谢物相关。
坐标轴: 同比较组的交互网络。
颜色: 同上。
点的形状与大小: 同上。
图例: 同上。
显著性标记: 可选“全部 30 个样本 r”和“校正组别 r”；相关边来自全局高相关配对（FDR 在全部已检验配对内校正）。
数据筛选: 在最多比较中联合显著的 10 条通路；分子为注释到这些通路、在任一比较差异、且有全局高相关配对的基因和代谢物。
样本与缺失值: 30 个样本；代谢物未检出值不参与计算（记为 NA）。
如何阅读: 同比较组网络。

三层网络汇总共 46 行下载全表

表注：set 比较或 global；pathways、genes、metabolites 网络中的通路、基因、代谢物数；annotation_edges 注释边数；correlation_pairs 网络内的全部基因 × 代谢物配对数；pass_all、pass_within、pass_cmp 分别为 30 样本 r、组内 r、6 样本 r 通过阈值的配对数；note 未建网络的原因。

set	pathways	genes	metabolites	annotation_edges	correlation_pairs	pass_all	pass_within	pass_cmp	note
R1_vs_Y1	10	68	13	93	884	59	0	206
R2_vs_Y2	10	74	14	116	1036	100	0	407
R3_vs_Y3	10	87	8	114	696	111	0	413
R4_vs_Y4	10	149	10	189	1490	129	0	736
R5_vs_Y5	10	153	16	198	2448	114	0	1631
R1_vs_R2	0	0	0						no co-mapped pathway
R1_vs_R3	0	0	0						no co-mapped pathway
R1_vs_R4	8	66	6	83	396	2	0	0
R1_vs_R5	10	164	10	194	1640	7	12	0
R2_vs_R3	0	0	0						no co-mapped pathway
R2_vs_R4	8	54	6	71	324	3	0	43
R2_vs_R5	10	130	6	167	780	5	2	230
R3_vs_R4	10	152	9	182	1368	6	0	393
R3_vs_R5	10	191	13	231	2483	17	3	1066
R4_vs_R5	8	44	6	64	264	0	0	5
Y1_vs_Y2	0	0	0						no co-mapped pathway
Y1_vs_Y3	1	1	1	2	1	0	0	0
Y1_vs_Y4	10	57	9	79	513	0	1	7
Y1_vs_Y5	10	83	10	113	830	4	0	0
Y2_vs_Y3	0	0	0						no co-mapped pathway
Y2_vs_Y4	10	35	13	59	455	1	0	61
Y2_vs_Y5	10	92	11	112	1012	3	0	0
Y3_vs_Y4	10	30	14	64	420	0	0	97
Y3_vs_Y5	10	125	13	161	1625	0	0	47
Y4_vs_Y5	5	27	5	40	135	0	0	0
R1_vs_Y2	10	59	12	93	708	69	0	246
R1_vs_Y3	10	62	12	91	744	73	0	215
R1_vs_Y4	10	148	14	180	2072	103	0	388
R1_vs_Y5	10	219	11	261	2409	122	0	746
R2_vs_Y1	10	73	11	101	803	80	0	335
R2_vs_Y3	10	103	12	134	1236	167	0	481
R2_vs_Y4	10	120	10	144	1200	35	0	259
R2_vs_Y5	10	200	14	247	2800	40	0	757
R3_vs_Y1	10	74	9	113	666	43	0	155
R3_vs_Y2	10	73	8	96	584	78	0	289
R3_vs_Y4	10	209	12	254	2508	26	0	901
R3_vs_Y5	10	245	11	308	2695	36	0	1174
R4_vs_Y1	10	183	11	243	2013	66	0	828
R4_vs_Y2	10	154	16	218	2464	114	0	857
R4_vs_Y3	10	155	14	229	2170	139	0	1003
R4_vs_Y5	10	188	16	233	3008	54	0	2001
R5_vs_Y1	10	207	11	294	2277	121	0	873
R5_vs_Y2	10	160	12	236	1920	99	0	680
R5_vs_Y3	10	189	14	283	2646	94	0	1088
R5_vs_Y4	10	170	16	225	2720	127	0	1927
global	10	88	15	111	240	240	0

各比较结果

7 结果描述

网络规模。40 个比较构建了网络，每个比较中位数为 122 个基因、11 个代谢物、152 条注释边；5 个比较没有共映射通路，不构建网络。

三种相关口径。网络内基因 × 代谢物配对中，30 样本 r 通过阈值的每个比较中位数 48 对；组内相关 FDR<0.05 的 45 个比较合计 18 对；6 样本 r 通过阈值的中位数 362 对，远多于另两种口径，说明 6 样本相关主要由两组差异决定。

全局网络的中心节点。相关边最多的代谢物依次为 (-)-Epigallocatechin（66 条）、Galanthamine（47 条）、4-Hydroxybenzoic Acid（43 条）。

8 生物学意义

数据支持的观察

在重点通路内部，30 样本高相关的基因–代谢物配对大量存在，但扣除组别后几乎全部消失：这些配对反映的是处理和水平对通路基因和代谢物的共同影响，而不是个体之间的协同。全局网络中连接最多的是表没食子儿茶素等少数代谢物，它们与大量通路基因同时随组别变化。

需要进一步验证的假设

与表没食子儿茶素相连、且属于类黄酮合成通路的酶基因（如 DFR、LDOX）是解释其积累差异的优先候选；但相关来自组间共变，需要在同一处理水平内增加样本，或用基因功能实验验证。

9 局限性

只纳入差异分子和排名靠前的通路，网络是“候选子网络”，不是完整的代谢网络。30 样本相关混合了组间和组内两种来源，大部分高相关由处理和水平共同驱动；扣除组别后（r_within）能通过阈值的配对很少，说明多数关联不能在个体层面复现。6 样本相关几乎必然很高，只作对照。相关不说明因果或直接调控，通路注释也不说明该酶确实作用于这个代谢物；有生化依据的配对见“已知反应配对”页。KEGG 参考通路以模式物种为主，物种特有的代谢可能缺失。

参考文献

Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Research, 2000, 28(1): 27–30.
Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B, 1995, 57(1): 289–300.
Cavill R, Jennen D, Kleinjans J, Briedé JJ. Transcriptomic and metabolomic data integration. Briefings in Bioinformatics, 2016, 17(5): 891–901.