动态趋势：完整技术报告

主要发现：Mfuzz 把差异分子分为 9 个趋势簇；k-means 对照与之一致度 ARI 为 0.50–0.67，60%–73% 的分子落入对应簇，主要趋势能在两种方法中重复，但相邻簇之间有分子交换。

本页保留全部详细说明；日常浏览请用简洁页面。

1 分析目的

把差异基因和差异代谢物放在一起，按它们随水平（和处理）变化的模式聚类，找出“变化轨迹相同”的基因和代谢物。同一簇里的基因和代谢物可能参与同一个响应过程，可作为候选的协同模块。

2 分析原理

输入矩阵：任一比较中的差异基因 ∪ 差异代谢物；每个分子按组取均值（3 个重复的平均），再在各组均值间做 z-score，消除量纲差异，只保留变化形状。分三套：R（R1–R5 共 5 组）、Y（Y1–Y5）、ALL（全部 10 组）。

Mfuzz 模糊 C 均值聚类：每个分子 i 对每个簇 k 有隶属度 u_ik（0–1，Σ_k u_ik = 1），最小化 Σ_iΣ_k u_ik^m‖x_i − c_k‖²。模糊系数 m 由 mestimate 按数据维度自动估计，m 越大划分越“软”。簇数 c=9。membership≥0.5 的分子用于作图和富集。

k-means 对照：同一 z-score 矩阵、相同簇数，30 个随机起点，取最优解。用调整兰德指数（ARI）和交叉表衡量两种方法的一致度：ARI = (Σ_ij C(n_ij,2) − E)/(½[Σ_i C(a_i,2) + Σ_j C(b_j,2)] − E)，n_ij 为交叉表计数，a、b 为行、列和，E 为随机期望。

簇富集：每个簇的基因、代谢物分别做 KEGG 超几何检验，背景为该集合的全部差异基因或差异代谢物（有注释者），BH 校正。

3 输入数据及预处理

差异基因、差异代谢物；基因 log2(FPKM+1)，代谢物 log2（半最小值填补）；组均值后 z-score。

4 软件、算法及参数

软件 / 函数	版本	用途与关键参数
Mfuzz	2.66.0	mestimate、mfuzz(c=9, m=自动)
stats::kmeans	4.4.3	centers=9, nstart=30, iter.max=100
stats::phyper / p.adjust	4.4.3	簇富集

5 统计指标解释

下表列出本页出现的全部统计指标和缩写（由页面内容自动生成）。全部术语见术语表。

术语	中文名	英文名	定义与读法
FPKM	每千碱基每百万片段数	Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped fragments	转录组表达量单位，按基因长度和测序深度归一化。本流程用 log2(FPKM+1) 作为基因表达值。
P	P 值	P value	在原假设（无差异、无相关或无富集）成立时，得到当前或更极端结果的概率，未经多重检验校正。
FDR	错误发现率	false discovery rate	多重检验校正指标，表示在所有判为显著的结果中，预期假阳性所占比例。本报告全部用 Benjamini–Hochberg 方法计算，检验范围在各分析中分别说明（如“该比较的全部配对”“全部可评估通路”）。
BH	Benjamini–Hochberg 校正	Benjamini–Hochberg procedure	把 m 个 P 值从小到大排序，第 i 个的校正值为 min(1, min_{k≥i} P_(k)·m/k)。控制 FDR，比 Bonferroni 校正宽松。
z-score	标准分数	z-score	(x − 均值)/标准差，把不同量纲的数据转换为“偏离均值多少个标准差”。z=1 表示高于均值 1 个标准差。
ARI	调整兰德指数	adjusted Rand index	两种聚类划分的一致度，按随机期望校正；1=完全一致，0≈随机水平。
KEGG	京都基因与基因组百科全书	Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes	代谢通路和分子功能数据库。本流程用 KEGG 通路、KO、化合物（C 编号）和反应（R 编号）注释。
WGCNA	加权基因共表达网络分析	weighted gene co-expression network analysis	把相关矩阵经软阈值幂次变换成加权网络，用拓扑重叠聚类得到共表达模块。
Mfuzz	Mfuzz 模糊聚类	Mfuzz soft clustering	基于模糊 C 均值的时间序列聚类，每个分子对每个簇有隶属度，适合噪声较大的表达模式。
membership	隶属度	membership	Mfuzz 中分子属于某簇的程度，0–1，所有簇之和为 1。
k-means	K 均值聚类	k-means clustering	把每个分子硬性分到距离最近的簇中心，迭代更新中心直到收敛。

6 图表与结果展示

全局结果

趋势分析只做全局（按组均值），不分比较。三个集合：R（R1–R5）、Y（Y1–Y5）、ALL（10 组）。

三套聚类汇总共 3 行下载全表

表注：set 集合；features、genes、mets 参与聚类的分子数；m 自动估计的模糊系数；ari Mfuzz 与 k-means 的调整兰德指数（1=完全一致，0=随机水平）；mean_membership 平均最高隶属度。

set	features	genes	mets	m	ari	mean_membership
R	15038	14257	781	1.994	0.495	0.4863
Y	15298	14518	780	1.994	0.5102	0.4325
ALL	15404	14620	784	1.298	0.6723	0.795

7 结果描述

聚类规模。R、Y、ALL 三套分别有 15,038、15,298、15,404 个分子（其中代谢物 781、780、784 个）。自动估计的模糊系数 m 为 1.99、1.99、1.30；平均最高隶属度为 0.49、0.43、0.79，R、Y 两套中较多分子的隶属度低于 0.5，簇边界较模糊。

方法稳健性。k-means 与 Mfuzz 的 ARI 为 R 0.50、Y 0.51、ALL 0.67；交叉表对角线占比为 60%、63%、73%。

簇功能（基因端，FDR<0.05 的前几条）。ALL 集合中，第 8 簇富集 Photosynthesis；Photosynthesis - antenna proteins；Ribosome；第 2 簇富集 Oxidative phosphorylation；Homologous recombination；DNA replication。R 集合第 7 簇富集 Protein processing in endoplasmic reticulum；Valine, leucine and isoleucine degradation；Y 集合第 3 簇富集 Homologous recombination；ATP-dependent chromatin remodeling；DNA replication。代谢物端 FDR<0.05 的簇富集结果共 2 条（ALL）。

8 生物学意义

数据支持的观察

差异基因和差异代谢物可以归入少数几种跨水平的变化模式，同一模式中基因和代谢物的均值轨迹形状一致。光合作用相关基因集中在同一个趋势簇中，说明它们随处理和水平整体协同变化，与 WGCNA 的 gblue 模块相互印证。

需要进一步验证的假设

同一簇中的代谢物可能是该簇基因功能的产物或底物，可据此挑选“基因—代谢物”候选组合；但趋势相同只说明模式相似，不说明调控关系。若水平代表时间或剂量，簇的形状可解释为响应的先后和方向，需先确认水平含义。

9 局限性

水平 1–5 是否有先后顺序尚待确认；如果水平不是时间或剂量梯度，“趋势”只代表组均值的模式，不代表动态过程。组均值后每套只有 5 或 10 个数据点，聚类结果对簇数敏感。趋势相同不代表调控关系。基因数量远多于代谢物，簇的形状主要由基因决定。

参考文献

Kumar L, Futschik ME. Mfuzz: a software package for soft clustering of microarray data. Bioinformation, 2007, 2(1): 5–7.
Hubert L, Arabie P. Comparing partitions. Journal of Classification, 1985, 2: 193–218.