转录因子调控：完整技术报告

1 分析目的

提出可以用实验验证的调控假设：哪些转录因子（TF）可能通过调控代谢通路基因，影响代谢物含量。分三层证据：TF 与代谢物共变、TF 对代谢通路基因的预测能力、以及 TF—结构基因—代谢物三元组。

2 分析原理

① TF-代谢物相关：注释为 TF 的表达基因与全部代谢物的 30 样本 Pearson 相关（未检出样本不参与），|r|≥0.8 且 BH FDR<0.05（在全部 TF × 代谢物内校正）。逐比较只展示该比较差异 TF × 差异代谢物中的配对。

② GENIE3：对每个代谢通路基因，用随机森林（500 棵树，每次分裂随机抽 √(TF 数) 个 TF）以全部 TF 的表达为特征做回归；TF 在森林中的重要性（不纯度下降）即 TF→基因的权重。权重只用于排序，没有显著性检验。本报告汇总每个 TF 在前 50 万条边上的权重之和。

③ 三元组：TF–基因：|r|≥0.8（且在 GENIE3 权重前 20 万条边内）；基因–代谢物：KEGG 已知酶-代谢物配对，或全局 Tier1 配对。中介提示：控制基因表达后（对 TF 和代谢物分别以基因表达做线性回归取残差），若 TF-代谢物偏相关的绝对值小于原相关的一半，且原相关 |r|≥0.6，记为 mediation_hint，提示 TF 对代谢物的关联可能经由该基因。

3 输入数据及预处理

服务商注释的 TF 家族；表达过滤后的基因（log2(FPKM+1)）；代谢物（log2，未检出为 NA）；代谢通路基因为注释到 KEGG 代谢类通路的表达基因。

4 软件、算法及参数

软件 / 函数	版本	用途与关键参数
GENIE3	1.28.0	GENIE3(nTrees=500, regulators=TF, targets=代谢通路基因)，getLinkList(reportMax=500000)
R	4.4.3	相关、lm 残差
ggalluvial	0.12.6	三元组桑基图

5 统计指标解释

下表列出本页出现的全部统计指标和缩写（由页面内容自动生成）。全部术语见术语表。

术语	中文名	英文名	定义与读法
FPKM	每千碱基每百万片段数	Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped fragments	转录组表达量单位，按基因长度和测序深度归一化。本流程用 log2(FPKM+1) 作为基因表达值。
log2FC	以 2 为底的倍数变化对数	log2 fold change	两组均值之比取 log2。本报告统一为 log2(后一组/前一组)，比较名 A_vs_B 中 B 为后一组；log2FC=1 表示后一组是前一组的 2 倍，-1 表示一半。基因的 log2FC 来自服务商 DESeq2 结果；代谢物为两组原始强度均值之比。两组都未检出时没有 log2FC（记为 NA，不是 0）。
FDR	错误发现率	false discovery rate	多重检验校正指标，表示在所有判为显著的结果中，预期假阳性所占比例。本报告全部用 Benjamini–Hochberg 方法计算，检验范围在各分析中分别说明（如“该比较的全部配对”“全部可评估通路”）。
BH	Benjamini–Hochberg 校正	Benjamini–Hochberg procedure	把 m 个 P 值从小到大排序，第 i 个的校正值为 min(1, min_{k≥i} P_(k)·m/k)。控制 FDR，比 Bonferroni 校正宽松。
NA	缺失值	not available	没有数值。未检出、未检验或不可计算时记为 NA，不当作 0。
r	相关系数	correlation coefficient	本报告中未特别说明时指 Pearson 积矩相关系数，范围 −1 到 1；正值表示同涨同落，负值表示此消彼长，绝对值越大线性关系越强。
Pearson	皮尔逊相关	Pearson correlation	r = Σ(x−x̄)(y−ȳ) / √[Σ(x−x̄)²·Σ(y−ȳ)²]，衡量线性关系。显著性用 t = r·√[df/(1−r²)] 服从自由度 df 的 t 分布检验。
r_all	全样本相关	correlation across all samples	30 个样本上的 Pearson r（代谢物未检出的样本不参与），包含组间差异和组内个体差异两部分。
Tier1	一级证据配对	Tier 1 pair	\|r_all\|≥0.8 且 FDR<0.05，同时组内相关 FDR<0.05 且与 r_all 同号。说明两者的关联在扣除组间差异后仍存在。
PC	主成分	principal component	PCA 得到的新坐标轴，PC1 解释的方差最多。
KEGG	京都基因与基因组百科全书	Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes	代谢通路和分子功能数据库。本流程用 KEGG 通路、KO、化合物（C 编号）和反应（R 编号）注释。
TF	转录因子	transcription factor	结合 DNA 调控其他基因转录的蛋白。本流程按服务商注释的 TF 家族识别。
GENIE3	基于树的基因网络推断	GEne Network Inference with Ensemble of trees	对每个目标基因用随机森林以全部 TF 的表达为特征做回归，特征重要性即 TF→目标基因的权重。

6 图表与结果展示

全局结果

**GENIE3 权重最高的转录因子**PDF 每个 TF 的汇总前 50 万条边绘图数据

GENIE3 排名前 30 的转录因子预览前 30 行，共 926 行

表注：total_weight 前 50 万条边内的权重和；n_links 其中的目标基因数；top_target、top_weight 权重最高的目标基因及其权重。

rank	tf	family	total_weight	n_links	top_target	top_weight
1	Ac_DH066619_chr7_04348	FAR1	7.953	1069	Ac_DH066619_chr6_01090	0.03867
2	Ac_DH066619_chr2_00818	MYB	7.398	1084	Ac_DH066619_chr8_00320	0.04143
3	Ac_DH066619_chr2_01405	BBR-BPC	7.303	1066	Ac_DH066619_chr2_01272	0.03691
4	Ac_DH066619_chr5_05136	LOB	7.062	1040	Ac_DH066619_chr5_01389	0.03762
5	Ac_DH066619_chr7_04346	bHLH	6.911	1024	Ac_DH066619_chr2_01293	0.0318
6	Ac_DH066619_chr1_04255	OFP	6.792	977	Ac_DH066619_chr4_03292	0.03537
7	Ac_DH066619_chr1_05003	MYB-related	6.726	915	Ac_DH066619_chr3_00175	0.0352
8	Ac_DH066619_chr5_01925	GARP-G2-like	6.638	1033	Ac_DH066619_chr4_04344	0.03778
9	Ac_DH066619_chr7_00096	PLATZ	6.407	725	Ac_DH066619_chr2_00473	0.04624
10	Ac_DH066619_chr7_01124	B3	6.402	925	Ac_DH066619_chr2_02196	0.03462
11	Ac_DH066619_chr6_02345	AP2/ERF-ERF	6.317	965	Ac_DH066619_chr5_01501	0.04156
12	Ac_DH066619_chr7_01544	zf-HD	6.176	967	Ac_DH066619_chr7_01664	0.03264
13	Ac_DH066619_chr2_06553	MYB-related	6.148	982	Ac_DH066619_chr7_01667	0.03549
14	Ac_DH066619_chr1_05004	MYB-related	6.084	819	Ac_DH066619_chr7_00763	0.0332
15	Ac_DH066619_chr3_03740	MADS-M-type	6.022	912	Ac_DH066619_chr5_00728	0.03087
16	Ac_DH066619_chr6_02344	AP2/ERF-ERF	6.009	886	Ac_DH066619_chr6_02174	0.03514
17	Ac_DH066619_chr2_06599	MYB-related	5.995	972	Ac_DH066619_chr2_05257	0.03002
18	Ac_DH066619_chr2_04784	S1Fa-like	5.979	947	Ac_DH066619_chr2_04975	0.03656
19	Ac_DH066619_chr7_00226	Alfin-like	5.91	874	Ac_DH066619_chr3_05489	0.03793
20	Ac_DH066619_chr6_01460	C2H2	5.799	923	Ac_DH066619_chr6_01686	0.03117
21	Ac_DH066619_chr1_03388	RWP-RK	5.761	841	Ac_DH066619_chr8_00783	0.03761
22	Ac_DH066619_chr2_02444	MADS-M-type	5.705	837	Ac_DH066619_chr5_02934	0.03208
23	Ac_DH066619_chr6_00588	zf-HD	5.637	851	Ac_DH066619_chr6_00792	0.04001
24	Ac_DH066619_chr2_02448	MADS-M-type	5.564	855	Ac_DH066619_chr1_06075	0.02854
25	Ac_DH066619_chr7_04089	B3	5.554	840	Ac_DH066619_chr6_01838	0.05613
26	Ac_DH066619_chr8_01551	CSD	5.513	884	Ac_DH066619_chr7_03448	0.03415
27	Ac_DH066619_chr2_01935	MYB-related	5.501	919	Ac_DH066619_chr8_03073	0.03614
28	Ac_DH066619_chr2_02107	NF-X1	5.467	982	Ac_DH066619_chr7_03444	0.03719
29	Ac_DH066619_chr1_06097	B3	5.455	805	Ac_DH066619_chr2_02196	0.03462
30	Ac_DH066619_chr7_03360	MYB-related	5.451	845	Ac_DH066619_chr2_06656	0.03305

各比较 TF-代谢物配对数共 45 行下载全表

表注：tf_de 差异 TF 数；pairs 差异 TF × 差异代谢物中高相关的配对数；tfs、mets 涉及的 TF 和代谢物数。

comparison	tf_de	pairs	tfs	mets
R1_vs_Y1	109	574	58	35
R2_vs_Y2	83	923	55	47
R3_vs_Y3	114	1155	62	64
R4_vs_Y4	177	1902	77	89
R5_vs_Y5	227	2181	91	107
R1_vs_R2	0	0	0	0
R1_vs_R3	0	0	0	0
R1_vs_R4	112	36	13	22
R1_vs_R5	204	117	37	28
R2_vs_R3	0	0	0	0
R2_vs_R4	104	28	16	16
R2_vs_R5	194	124	36	30
R3_vs_R4	174	47	19	24
R3_vs_R5	235	142	47	39
R4_vs_R5	55	1	1	1
Y1_vs_Y2	1	1	1	1
Y1_vs_Y3	0	0	0	0
Y1_vs_Y4	88	18	11	11
Y1_vs_Y5	114	36	15	17
Y2_vs_Y3	0	0	0	0
Y2_vs_Y4	67	28	10	16
Y2_vs_Y5	105	18	11	13
Y3_vs_Y4	28	4	1	4
Y3_vs_Y5	104	18	7	16
Y4_vs_Y5	58	2	2	2
R1_vs_Y2	89	638	55	38
R1_vs_Y3	99	875	62	48
R1_vs_Y4	185	495	67	37
R1_vs_Y5	248	669	76	53
R2_vs_Y1	105	760	58	39
R2_vs_Y3	96	1205	63	57
R2_vs_Y4	191	711	66	42
R2_vs_Y5	248	876	75	54
R3_vs_Y1	144	795	54	41
R3_vs_Y2	101	881	54	47
R3_vs_Y4	238	678	68	44
R3_vs_Y5	311	847	78	61
R4_vs_Y1	203	2214	93	91
R4_vs_Y2	178	2034	80	98
R4_vs_Y3	186	2564	90	108
R4_vs_Y5	162	2048	78	100
R5_vs_Y1	248	2317	109	102
R5_vs_Y2	237	2321	104	111
R5_vs_Y3	235	2651	109	126
R5_vs_Y4	247	1910	94	92

各比较结果

左侧选择比较。比较名 A_vs_B 中 log2FC = log2(B/A)。

7 结果描述

TF-代谢物相关。|r|≥0.8 且 FDR<0.05 的 TF-代谢物配对 4,972 对，涉及 273 个 TF、312 个代谢物。配对最多的家族为 MYB-related、MADS-M-type、B3（692、635、288 对）。与类黄酮的配对共 1,393 对，最多的家族为 MADS-M-type、MYB-related、B3。

GENIE3。权重和最高的 TF 是 Ac_DH066619_chr7_04348（FAR1 家族，权重和 7.95）。前 30 个 TF 中 MYB-related 家族有 6 个。前后排名的权重差距较小（第 1 名 7.95，第 30 名 5.45）。

三元组。共 17,858 条 TF—基因—代谢物三元组，其中基因-代谢物有 KEGG 已知反应支持的 17,807 条，有中介提示的 130 条。

逐比较。各比较差异 TF 与差异代谢物的高相关配对数中位数为 638，最多的是 R5_vs_Y3（2,651 对）。

8 生物学意义

数据支持的观察

MYB 类和 bHLH 类转录因子是已知的类黄酮合成调控因子（R2R3-MYB、bHLH 与 WD40 组成的复合体调控类黄酮结构基因）[24]。本数据中，与类黄酮高相关的配对里 MYB-related 家族排在前列（排第一的是 MADS-M-type，其与类黄酮合成的直接调控关系文献证据较少），GENIE3 前 30 个 TF 中 MYB 类最多。这些只是相关和共表达上的提示，与已知调控模式相符，但不能说明本数据中哪个转录因子直接调控类黄酮合成。

需要进一步验证的假设

与类黄酮高相关、且对类黄酮合成基因 GENIE3 权重高的 MYB/bHLH 成员，可作为调控类黄酮积累的候选 TF。这些都是统计推断，需要启动子顺式元件分析、酵母单杂交、EMSA、双荧光素酶或转基因实验验证。MADS-M-type 等家族与类黄酮的大量相关更可能是随处理共同变化，而非直接调控。

9 局限性

全部是统计推断，没有启动子序列、结合位点或互作证据，不能说明直接调控。TF 的调控常发生在蛋白活性和翻译后层面，mRNA 水平不一定反映其活性。GENIE3 在 30 个样本上的权重估计不稳定，前后排名有较大随机性。中介提示是简单的偏相关比较，不是正式的中介分析。

参考文献

Huynh-Thu VA, Irrthum A, Wehenkel L, Geurts P. Inferring regulatory networks from expression data using tree-based methods. PLoS ONE, 2010, 5(9): e12776.
Winkel-Shirley B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology, 2001, 126(2): 485–493.