局限性

  1. 研究对象和设计信息待确认。资料中没有写明物种、R/Y 的含义和水平 1–5 的含义。基因注释的 NR 最佳比对物种多为石刁柏（Asparagus officinalis），仅作参考。趋势分析把水平 1–5 当作有序变量；如果水平不是时间或剂量梯度，趋势结果需要重新解读。
  2. 样本量小。每组 3 个重复，单个比较只有 6 个样本。逐比较的 O2PLS、CCA、PLS、DIABLO 只能用于描述，不能用来预测或判断模型泛化能力。全局模型的 30 个样本也不足以支撑独立验证。
  3. 相关不等于因果。r_all 跨全部 30 个样本计算，处理和水平的差异会让本无直接联系的分子表现为高相关。主筛选结果中只有很小一部分在组内也成立（Tier1），其余应视为组间共变。TF-基因-代谢物三元组同样只是调控假设。
  4. 代谢物差异未做多重检验校正。沿用服务商规则（P<0.05、FC≥2、VIP≥1），P 值未校正，存在假阳性。基因差异使用校正后 P。两组学的显著性标准因此不对等。
  5. 代谢物鉴定有不确定性。注释等级分 1、2、3 级，等级 3 的可信度较低。部分物质（例如含氟、溴、碘的分子式）在植物样本中不太合理，已在 met_annot.tsv 的 id_doubtful 列标记。具体分子要先用标准品确认，再做生物学解释。
  6. 注释覆盖有限。代谢物只有约三分之一有 KEGG 编号，通路分析只反映这部分物质；代谢组通路的命中数通常只有 1–3 个，联合富集多由基因端驱动。
  7. KEGG 参考通路的物种过滤。只保留 7 种植物（拟南芥、水稻、石刁柏、葡萄、大豆、番茄、玉米）至少一种具有的通路，并排除甜菜色素等明显不适用的通路。这样可减少动物和细菌通路的干扰，也可能漏掉少数物种特有的通路。
  8. 未检出填补。填补值会影响倍数和相关，极端 log2FC 不代表真实倍数。
  9. 20 个跨水平跨处理比较的代谢组结果是补算的。服务商只提供了 25 个比较。补算规则在这 25 个比较上复现了 P 和 FC；VIP 依赖模型，有个别边界物质与服务商不同。
  10. R12 与 R13 的标签问题未解决。交换这两个样本后，组内 Mantel 明显升高，提示可能存在标签对调。本报告按原标签分析；建议核对原始记录。若确认对调，需要改样本表后重跑。
  11. KEGG 使用限制。通路数据和图片来自 KEGG REST 接口，仅限学术使用；图片版权归 Kanehisa Laboratories，发表时需要申请许可。