关键通路与核心分子：完整技术报告

主要发现：综合 5 类证据，排名第一的是 Flavonoid biosynthesis（分数 0.969），其后是 Pentose and glucuronate interconversions、Tyrosine metabolism。

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1 分析目的

把分散在多个分析中的证据汇总成一个优先级排序，帮助选出最值得深入研究的通路和分子。

2 分析原理

通路综合分数：对每条通路取 5 项指标——联合显著的比较数（第 05 步）、共富集的比较数（第 05 步）、GSEA 两组学同向显著的比较数（第 06 步）、通路活性耦合 |r|（第 16 步）、已知酶-代谢物配对数（第 11 步）——在全部通路内分别转换为百分位（并列取平均秩），综合分数为可用指标百分位的算术平均。某指标不可计算（如通路分子太少，无法算耦合）时记为 NA，不当作最低分，只平均其余指标。关键通路取综合分数最高、且至少在 1 个比较中联合显著的 30 条。

核心分子分数：对关键通路中的每个基因或代谢物，取 5 项——差异比较数、全局 Tier1 配对数、全局 O2PLS 第一联合载荷绝对值、是否 WGCNA 枢纽（0/1）、是否有 KEGG 已知反应配对（0/1）——前三项在该通路同一组学内转为百分位，与后两项求平均。

3 输入数据及预处理

第 05、06、11、16 步的通路结果；第 04（差异计数）、08（Tier1）、11（已知反应）、12（O2PLS 载荷）、14（WGCNA 枢纽）步的分子结果。

4 软件、算法及参数

软件 / 函数	版本	用途与关键参数
R / data.table	1.18.6.1	百分位转换（rank / n）与平均

5 统计指标解释

下表列出本页出现的全部统计指标和缩写（由页面内容自动生成）。全部术语见术语表。

术语	中文名	英文名	定义与读法
NA	缺失值	not available	没有数值。未检出、未检验或不可计算时记为 NA，不当作 0。
z-score	标准分数	z-score	(x − 均值)/标准差，把不同量纲的数据转换为“偏离均值多少个标准差”。z=1 表示高于均值 1 个标准差。
r	相关系数	correlation coefficient	本报告中未特别说明时指 Pearson 积矩相关系数，范围 −1 到 1；正值表示同涨同落，负值表示此消彼长，绝对值越大线性关系越强。
Pearson	皮尔逊相关	Pearson correlation	r = Σ(x−x̄)(y−ȳ) / √[Σ(x−x̄)²·Σ(y−ȳ)²]，衡量线性关系。显著性用 t = r·√[df/(1−r²)] 服从自由度 df 的 t 分布检验。
Tier1	一级证据配对	Tier 1 pair	\|r_all\|≥0.8 且 FDR<0.05，同时组内相关 FDR<0.05 且与 r_all 同号。说明两者的关联在扣除组间差异后仍存在。
KEGG	京都基因与基因组百科全书	Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes	代谢通路和分子功能数据库。本流程用 KEGG 通路、KO、化合物（C 编号）和反应（R 编号）注释。
KO	KEGG 直系同源编号	KEGG Orthology	K 开头的编号，把不同物种的同功能基因归为一类，用于把基因映射到通路。
GSEA	基因集富集分析	gene set enrichment analysis	把全部基因按差异程度排序，检验某通路的基因是否集中在排序的一端，不需要预先设定差异阈值。
WGCNA	加权基因共表达网络分析	weighted gene co-expression network analysis	把相关矩阵经软阈值幂次变换成加权网络，用拓扑重叠聚类得到共表达模块。
kME	模块隶属度	module membership (eigengene-based connectivity)	分子与所在模块特征值的相关（本流程用 bicor），越接近 1 越能代表该模块。
hub	枢纽分子	hub	本流程定义为 \|kME\|≥0.9 的模块成员。
O2PLS	双向正交偏最小二乘	two-way orthogonal partial least squares	把两组学各自分解为联合部分（两边共变）、各自特有的正交部分和残差。
TF	转录因子	transcription factor	结合 DNA 调控其他基因转录的蛋白。本流程按服务商注释的 TF 家族识别。
CHI	查尔酮异构酶	chalcone isomerase	K01859，把查尔酮异构化为黄烷酮（柚皮素）。
F3H	黄烷酮 3-羟化酶	flavanone 3-hydroxylase	K00475，把黄烷酮转化为二氢黄酮醇。
F3′H	类黄酮 3′-羟化酶	flavonoid 3'-hydroxylase	K05280，在 B 环 3′ 位加羟基，决定花旗松素等的形成。
DFR	二氢黄酮醇 4-还原酶	dihydroflavonol 4-reductase	K13082，把二氢黄酮醇还原为无色花色素，是花色素和原花青素分支的入口。
LDOX	无色花色素双加氧酶	leucoanthocyanidin dioxygenase	又称花色素合酶（ANS），K05277，把无色花色素转化为花色素。
ANS	花色素合酶	anthocyanidin synthase	即 LDOX。

6 图表与结果展示

全局结果

关键通路共 22 行下载全表

表注：rank 排名；n_co_enriched、n_joint_sig 共富集、联合显著的比较数；n_gsea_both GSEA 两边同向显著的比较数；coupling_r、coupling_within 通路活性耦合（30 样本、组内）；known_pairs 已知酶-代谢物配对数；score 综合分数（0–1）。

rank	pid	name	n_co_enriched	n_joint_sig	n_gsea_both	coupling_r	coupling_within	known_pairs	score
1	00941	Flavonoid biosynthesis	7	18	1	0.4621	0.06848	78	0.9692
2	00040	Pentose and glucuronate interconversions	2	13	0	0.3881	0.293	28	0.8257
3	00350	Tyrosine metabolism	1	8	0	-0.258	-0.1927	61	0.7867
4	00500	Starch and sucrose metabolism	0	5	0	-0.6186	-0.2909	353	0.7804
5	00940	Phenylpropanoid biosynthesis	0	15	0	-0.2966	-0.172	328	0.7403
6	00600	Sphingolipid metabolism	0	2	0	-0.3862	-0.4454	88	0.7363
7	00901	Indole alkaloid biosynthesis	0	2	0	-0.6237	-0.4664	10	0.7044
8	00270	Cysteine and methionine metabolism	1	1	0	0.007503	-0.212	183	0.6727
9	00480	Glutathione metabolism	0	1	0	0.26	0.335	36	0.6617
10	00541	Biosynthesis of various nucleotide sugars	0	1	0			30	0.6603
11	00360	Phenylalanine metabolism	0	6	0	-0.1968	-0.2406	95	0.6551
16	00130	Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis	0	9	0	0.1853	-0.07699	15	0.6105
17	00630	Glyoxylate and dicarboxylate metabolism	0	4	0	0.08344	-0.0119	172	0.6102
19	00400	Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis	0	1	0	-0.1322	-0.323	71	0.604
20	00520	Amino sugar and nucleotide sugar metabolism	0	2	0	-0.07191	-0.05861	173	0.5975
21	00380	Tryptophan metabolism	0	3	0	0.1434	-0.3383	22	0.5956
22	00950	Isoquinoline alkaloid biosynthesis	0	7	0	0.09203	-0.2469	38	0.5939
26	00053	Ascorbate and aldarate metabolism	0	3	0	0.04773	-0.04914	69	0.5826
33	00960	Tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis	0	8	0	0.0324	-0.0102	28	0.5603
38	00591	Linoleic acid metabolism	0	4	0			0	0.5491
41	00195	Photosynthesis	0	3	0			0	0.5448
48	00999	Biosynthesis of various plant secondary metabolites	0	1	0	-0.08776	0.047	7	0.53

核心分子（按分子分数排序）预览前 60 行，共 2,121 行下载全表

表注：pid 通路；omics 组学；name 代谢物名称；ko 基因的 KO；tf TF 家族；n_de 差异比较数；t1 全局 Tier1 配对数；module、kME WGCNA 模块和模块隶属度；hub 是否枢纽；o2 全局 O2PLS 第一联合载荷绝对值；known 是否有已知反应配对；core 分子分数（0–1）。

pid	omics	id	name	ko	n_de	module	kME	hub	o2	known	core
00130	met	NEG_q48	4-Hydroxybenzoic Acid		17	brown	0.943	是	0.05637	是	0.9333
00940	gene	Ac_DH066619_chr1_02645		K09753	27	blue	0.9603	是	0.02229	是	0.8965
00053	gene	Ac_DH066619_chr5_03081		K00128	25	yellow	0.9539	是	0.02307	是	0.8947
00500	gene	Ac_DH066619_chr3_05798		K00696	25	blue	0.9592	是	0.02318	是	0.8924
00630	gene	Ac_DH066619_chr1_05008		K01681	26	blue	0.9569	是	0.02275	是	0.8919
00270	gene	Ac_DH066619_chr1_06075		K05933	26	yellow	0.9786	是	0.02264	是	0.8906
00270	gene	Ac_DH066619_chr7_04135		K00549	20	yellow	0.9878	是	0.02337	是	0.8904
00940	gene	Ac_DH066619_chr7_00626		K09753	28	yellow	0.9019	是	0.02089	是	0.8886
00520	gene	Ac_DH066619_chr7_01664		K00844	25	blue	0.9321	是	0.0214	是	0.8865
00500	gene	Ac_DH066619_chr1_01770		K01179	25	yellow	0.9744	是	0.02305	是	0.886
00940	gene	Ac_DH066619_chr6_00708		K00430	25	yellow	0.9196	是	0.02137	是	0.8859
00053	gene	Ac_DH066619_chr3_04355		K00469	25	yellow	0.9728	是	0.02283	是	0.8851
00053	gene	Ac_DH066619_chr2_02309		K00128	27	yellow	0.906	是	0.0217	是	0.8823
00500	gene	Ac_DH066619_chr6_05075		K01179	25	yellow	0.9751	是	0.023	是	0.8795
00630	gene	Ac_DH066619_chr2_03646		K15893	21	blue	0.9107	是	0.02252	是	0.8731
00500	gene	Ac_DH066619_chr1_05570		K01176	25	yellow	0.9141	是		是	0.8656
00500	gene	Ac_DH066619_chr3_02636		K05350	25	blue	0.9551	是		是	0.8656
00630	gene	Ac_DH066619_chr5_03284		K01681	25	blue	0.9474	是	0.02197	是	0.8628
00500	gene	Ac_DH066619_chr7_01664		K00844	25	blue	0.9321	是	0.0214	是	0.8602
00500	gene	Ac_DH066619_chr3_04676		K16055	18	blue	0.9114	是		是	0.8481
00630	gene	Ac_DH066619_chr8_02023		K11517	24	yellow	0.9258	是	0.02136	是	0.8475
00940	gene	Ac_DH066619_chr4_04502		K01904	20	blue	0.943	是		是	0.8472
00901	gene	Ac_DH066619_chr5_02834		K01593	24	red	0.9348	是	0.006791	是	0.8409
00500	gene	Ac_DH066619_chr4_00462		K01810	15	purple	0.9178	是		是	0.8394
00940	gene	Ac_DH066619_chr5_02960		K09753	10	yellow	0.9227	是	0.0219	是	0.8365
00630	gene	Ac_DH066619_chr6_01645		K19269	30	blue	0.901	是	0.02066	是	0.8364
00520	gene	Ac_DH066619_chr6_01623		K01183	14	blue	0.9275	是		是	0.8317
00630	gene	Ac_DH066619_chr5_04813		K00026	13	blue	0.9423	是		是	0.8241
00520	gene	Ac_DH066619_chr3_03237		K01209	22	brown	0.9278	是	0.009109	是	0.8133
00270	gene	Ac_DH066619_chr3_05663		K01738	9	turquoise	0.9281	是		是	0.8114
00360	met	POS_q32	2-Phenylethylamine		7	black	0.9042	是	0.02402	是	0.8111
00950	gene	Ac_DH066619_chr5_02834		K01593	24	red	0.9348	是	0.006791	是	0.8099
00270	met	POS_q273	L-Homoserine-1		7	yellow	0.9095	是	0.01965	是	0.8083
00350	gene	Ac_DH066619_chr5_02834		K01593	24	red	0.9348	是	0.006791	是	0.8037
00480	gene	Ac_DH066619_chr2_01020		K00434	20	magenta	0.9036	是	0.01281	是	0.7989
00360	gene	Ac_DH066619_chr5_02834		K01593	24	red	0.9348	是	0.006791	是	0.7981
00270	gene	Ac_DH066619_chr3_00923		K00640	7	brown	0.9227	是		是	0.7904
00380	gene	Ac_DH066619_chr5_02834		K01593	24	red	0.9348	是	0.006791	是	0.7776
00940	gene	Ac_DH066619_chr2_04751		K00430	16	red	0.9186	是	0.01102	是	0.7763
00500	gene	Ac_DH066619_chr7_00433		K01087	26	purple	0.9403	是	0.006428	是	0.7757
00500	gene	Ac_DH066619_chr2_00851		K16055	3	salmon	0.9201	是		是	0.7733
00053	gene	Ac_DH066619_chr2_01020		K00434	20	magenta	0.9036	是	0.01281	是	0.7726
00480	met	NEG_q211	L-Glutamic Acid		0	red	0.9216	是	0.009597	是	0.7667
00130	met	NEG_q219	L-Tyrosine		0	yellow	0.9233	是	0.0101	是	0.7667
00940	gene	Ac_DH066619_chr2_04752		K00430	14	red	0.9357	是	0.01077	是	0.7585
00940	gene	Ac_DH066619_chr2_00771		K00083	3	turquoise	0.9139	是		是	0.758
00270	gene	Ac_DH066619_chr4_01498		K20772	17	red	0.9268	是	0.008977	是	0.754
00940	gene	Ac_DH066619_chr3_04146		K00430	7	red	0.9078	是	0.01182	是	0.7436
00480	gene	Ac_DH066619_chr3_03290		K01469	2	turquoise	0.9763	是		是	0.7345
00480	met	NEG_q207	L-Ascorbic Acid		6	brown	0.6466	否	0.04391	是	0.7333
00130	gene	Ac_DH066619_chr7_00015		K06125	3	turquoise	0.9201	是		是	0.733
00901	gene	Ac_DH066619_chr5_02835		K01593	22	purple	0.91	是	0.000717	是	0.7227
00130	gene	Ac_DH066619_chr7_00021		K06125	2	turquoise	0.9136	是		是	0.7216
00400	gene	Ac_DH066619_chr7_01586		K15227	14	red	0.9003	是	0.003925	是	0.7207
00600	met	POS_q160	D-Erythro-Dihydrosphingosine		8	blue	0.7581	否	0.02925	是	0.7167
00950	met	POS_q200	Galanthamine		15	turquoise	0.921	是	0.05914	否	0.7143
00350	gene	Ac_DH066619_chr5_02835		K01593	22	purple	0.91	是	0.000717	是	0.7134
00400	met	POS_q95	Anthranilic Acid		17	turquoise	0.8341	否	0.05325	是	0.7125
00400	met	POS_t272	L-PHENYLALANINE		0	yellow	0.9199	是	0.01349	是	0.7125
00500	gene	Ac_DH066619_chr6_00973		K01087	25	purple	0.9125	是	0.000851	是	0.7118

每条关键通路

关键通路 22

7 结果描述

通路排名。前 5 条依次为：Flavonoid biosynthesis（0.969）；Pentose and glucuronate interconversions（0.826）；Tyrosine metabolism（0.787）；Starch and sucrose metabolism（0.78）；Phenylpropanoid biosynthesis（0.74）。排名第一的类黄酮生物合成在 18 个比较中联合显著、7 个比较中共富集、有 78 个已知酶-代谢物配对，通路活性耦合 r=0.46（组内 0.07）。

类黄酮通路的核心分子。分子分数最高的基因 KO 依次为 K13082、K13082、K05277、K05277、K01859、K05280；代谢物为 Tricetin、(-)-Epigallocatechin、Dihydromyricetin、(+)-Taxifolin。前 6 个基因所属 WGCNA 模块中最多的是 magenta （3 个）。

8 生物学意义

数据支持的观察

多条独立证据（联合富集、GSEA、WGCNA 模块、已知反应）都指向类黄酮生物合成。核心分子集中在二氢黄酮醇到黄烷-3-醇/花色素这一段：二氢黄酮醇 4-还原酶（DFR，K13082）、无色花色素双加氧酶（LDOX/ANS，K05277）、黄烷酮 3-羟化酶（F3H，K00475）、类黄酮 3′-羟化酶（F3′H，K05280）、查尔酮异构酶（CHI，K01859），以及二氢黄酮醇类（花旗松素、二氢杨梅素）和黄烷-3-醇类（表没食子儿茶素）代谢物，这些酶与代谢物在通路上首尾相连 [24]。

需要进一步验证的假设

处理和水平可能主要影响二氢黄酮醇之后的分支（原花青素/花色素方向）。建议优先验证 DFR、LDOX 与表没食子儿茶素、花旗松素等的对应关系：测定这些物质含量，检测 DFR、LDOX 表达与酶活，并结合候选 MYB/bHLH 转录因子做调控验证。代谢物鉴定需先用标准品确认。综合分数只用于排序，不是显著性。

9 局限性

分数只用于排序，不是统计显著性，也没有置信区间。5 项指标等权是人为设定，换权重排序会变化；指标之间并不独立（例如联合显著和共富集高度相关），相当于加重了富集类证据。建议结合研究目的从前列通路中挑选，而不是只看第一名。

参考文献

Kanehisa M, Goto S. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. Nucleic Acids Research, 2000, 28(1): 27–30.
Winkel-Shirley B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology, 2001, 126(2): 485–493.