差异总览：完整技术报告

主要发现：同水平 R vs Y 的差异基因从水平 1 的 2,798 个增加到水平 5 的 5,325 个；同一处理内水平 1–3 之间几乎没有差异（3–25 个差异基因），差异集中在涉及水平 4、5 的比较。

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1 分析目的

统计 45 个比较中两组学的差异分子数量和重叠，判断哪些比较变化大、哪些几乎没有变化，为后续通路和相关分析划定可信范围。差异分子很少的比较，其通路富集和模型结果不稳定。

2 分析原理

差异基因：log2FC、P、padj 沿用服务商 DESeq2 结果。DESeq2 用负二项广义线性模型估计每个基因在两组间的 log2FC，Wald 检验得到 P，再在全部检验基因内用 Benjamini–Hochberg（BH）方法得到校正后 P（padj）。判定标准：校正后 P（padj）<0.05 且 |log2FC|≥1；上调/下调由本流程按此标准逐行判定，不直接使用服务商表中的 regulated 列（全部 45 个比较中有 2 行服务商标记与 |log2FC| 阈值不符，已按阈值改判，原标记保留在 vendor_regulated 列）。服务商差异表中没有统计结果的基因（低表达被过滤）记为“未检验”，不当作“无显著差异”。

差异代谢物：P<0.05、FC≥2（或 ≤0.5）且 VIP≥1。P 来自两组原始强度的 Welch t 检验（不假设方差相等），未做多重检验校正；log2FC = log2(后一组均值/前一组均值)；VIP 来自 OPLS-DA 模型（1 个预测成分 + 1 个正交成分，log2 数据，单位方差标准化），VIP_j = √[p·Σ_a (w_ja²·SS_a)/Σ_a SS_a]，其中 p 为变量数，w_ja 为变量 j 在成分 a 上的权重，SS_a 为成分 a 解释的 y 方差。服务商只提供了 25 个比较，另外 20 个比较由本流程用同一规则补算；补算规则先在 25 个服务商比较上复现核对。

UpSet 交集图：比较同一类比较内各比较差异分子集合的交集，每根柱是“只属于这一组合”的分子数。

3 输入数据及预处理

服务商差异基因表（45 个比较）；代谢物原始强度矩阵、服务商差异代谢物表（25 个比较）。比较分 4 类：A 同水平 R vs Y（5 个）；B R 内跨水平（10 个）；C Y 内跨水平（10 个）；D 跨水平跨处理（20 个）。log2FC 统一为 log2(后一组/前一组)。

只在一组检出的代谢物，log2FC 用填补下限计算，是估算值，可能出现 ±15 以上的极端值，图中用三角标出。两组都未检出的代谢物没有 log2FC，不参与差异判定和后续排序。

4 软件、算法及参数

软件 / 函数	版本	用途与关键参数
DESeq2（服务商）	服务商版本	负二项 GLM，Wald 检验，BH 校正
stats::t.test	4.4.3	Welch t 检验，原始强度
ropls	1.38.0	opls(predI=1, orthoI=1, crossvalI=5)，取 VIP；不收敛时退回 PLS-DA
UpSetR	1.4.1	upset(nintersects=30, order.by="freq")

5 统计指标解释

下表列出本页出现的全部统计指标和缩写（由页面内容自动生成）。全部术语见术语表。

术语	中文名	英文名	定义与读法
log2FC	以 2 为底的倍数变化对数	log2 fold change	两组均值之比取 log2。本报告统一为 log2(后一组/前一组)，比较名 A_vs_B 中 B 为后一组；log2FC=1 表示后一组是前一组的 2 倍，-1 表示一半。基因的 log2FC 来自服务商 DESeq2 结果；代谢物为两组原始强度均值之比。两组都未检出时没有 log2FC（记为 NA，不是 0）。
FC	倍数变化	fold change	两组均值之比。差异代谢物要求 FC≥2 或 ≤0.5，即 \|log2FC\|≥1。
P	P 值	P value	在原假设（无差异、无相关或无富集）成立时，得到当前或更极端结果的概率，未经多重检验校正。
padj	校正后 P 值	adjusted P value	经 Benjamini–Hochberg 方法校正后的 P 值，与 FDR 含义相同。基因差异的 padj 由服务商 DESeq2 在全部检验基因内计算。
BH	Benjamini–Hochberg 校正	Benjamini–Hochberg procedure	把 m 个 P 值从小到大排序，第 i 个的校正值为 min(1, min_{k≥i} P_(k)·m/k)。控制 FDR，比 Bonferroni 校正宽松。
VIP	变量投影重要性	variable importance in projection	OPLS-DA 模型中每个代谢物对分组区分的贡献，所有变量 VIP 的平方均值为 1，VIP≥1 表示贡献高于平均。
OPLS-DA	正交偏最小二乘判别分析	orthogonal partial least squares discriminant analysis	有监督的多变量模型，把变异分成与分组相关的预测成分和与分组无关的正交成分；本流程用它计算差异代谢物的 VIP。
DESeq2	DESeq2 差异表达分析	DESeq2	基于负二项分布的 RNA-seq 差异表达方法，服务商用它给出基因的 log2FC、P 和 padj。
UpSet	UpSet 集合交集图	UpSet plot	用点阵表示集合组合、柱高表示该组合独有元素数的交集图，比韦恩图更适合多个集合。

6 图表与结果展示

全局结果

各比较差异分子数共 45 行下载全表

表注：gene_up、gene_down、met_up、met_down 为上调、下调数（方向为后一组相对前一组）；gene_total、met_total 为合计；met_source 代谢组结果来源。

comparison	category	met_source	gene_down	gene_up	met_down	met_up	gene_total	met_total
R1_vs_Y1	A_同水平处理间	vendor	1371	1427	34	41	2798	75
R2_vs_Y2	A_同水平处理间	vendor	1133	1256	56	47	2389	103
R3_vs_Y3	A_同水平处理间	vendor	1330	1713	57	67	3043	124
R4_vs_Y4	A_同水平处理间	vendor	2056	2166	112	38	4222	150
R5_vs_Y5	A_同水平处理间	vendor	2540	2785	124	107	5325	231
R1_vs_R2	B_R组内跨水平	vendor	4	5	4	5	9	9
R1_vs_R3	B_R组内跨水平	vendor	2	1	6	4	3	10
R1_vs_R4	B_R组内跨水平	vendor	1643	530	11	47	2173	58
R1_vs_R5	B_R组内跨水平	vendor	2953	2081	9	56	5034	65
R2_vs_R3	B_R组内跨水平	vendor	5	3	7	5	8	12
R2_vs_R4	B_R组内跨水平	vendor	1492	417	13	38	1909	51
R2_vs_R5	B_R组内跨水平	vendor	2789	1772	21	48	4561	69
R3_vs_R4	B_R组内跨水平	vendor	2010	1190	18	81	3200	99
R3_vs_R5	B_R组内跨水平	vendor	3032	2424	21	75	5456	96
R4_vs_R5	B_R组内跨水平	vendor	654	404	19	16	1058	35
Y1_vs_Y2	C_Y组内跨水平	vendor	3	1	8	3	4	11
Y1_vs_Y3	C_Y组内跨水平	vendor	8	17	12	7	25	19
Y1_vs_Y4	C_Y组内跨水平	vendor	772	450	24	52	1222	76
Y1_vs_Y5	C_Y组内跨水平	vendor	1281	805	35	75	2086	110
Y2_vs_Y3	C_Y组内跨水平	vendor	0	3	8	4	3	12
Y2_vs_Y4	C_Y组内跨水平	vendor	602	372	17	85	974	102
Y2_vs_Y5	C_Y组内跨水平	vendor	1295	1083	25	81	2378	106
Y3_vs_Y4	C_Y组内跨水平	vendor	346	153	24	79	499	103
Y3_vs_Y5	C_Y组内跨水平	vendor	1395	954	26	99	2349	125
Y4_vs_Y5	C_Y组内跨水平	vendor	696	508	12	18	1204	30
R1_vs_Y2	D_跨水平跨处理	pipeline	1193	1373	45	39	2566	84
R1_vs_Y3	D_跨水平跨处理	pipeline	1269	1568	42	51	2837	93
R1_vs_Y4	D_跨水平跨处理	pipeline	2140	1773	32	52	3913	84
R1_vs_Y5	D_跨水平跨处理	pipeline	2968	2823	42	100	5791	142
R2_vs_Y1	D_跨水平跨处理	pipeline	1292	1310	41	36	2602	77
R2_vs_Y3	D_跨水平跨处理	pipeline	1215	1445	58	61	2660	119
R2_vs_Y4	D_跨水平跨处理	pipeline	2242	1723	51	47	3965	98
R2_vs_Y5	D_跨水平跨处理	pipeline	2977	2706	57	108	5683	165
R3_vs_Y1	D_跨水平跨处理	pipeline	1623	1725	48	34	3348	82
R3_vs_Y2	D_跨水平跨处理	pipeline	1319	1568	58	50	2887	108
R3_vs_Y4	D_跨水平跨处理	pipeline	2453	2162	71	63	4615	134
R3_vs_Y5	D_跨水平跨处理	pipeline	3415	3386	78	125	6801	203
R4_vs_Y1	D_跨水平跨处理	pipeline	2212	2673	151	46	4885	197
R4_vs_Y2	D_跨水平跨处理	pipeline	2202	2616	163	46	4818	209
R4_vs_Y3	D_跨水平跨处理	pipeline	2204	2725	172	65	4929	237
R4_vs_Y5	D_跨水平跨处理	pipeline	2034	2229	127	101	4263	228
R5_vs_Y1	D_跨水平跨处理	pipeline	2775	3380	135	43	6155	178
R5_vs_Y2	D_跨水平跨处理	pipeline	2904	3425	156	48	6329	204
R5_vs_Y3	D_跨水平跨处理	pipeline	2855	3544	168	68	6399	236
R5_vs_Y4	D_跨水平跨处理	pipeline	2930	3029	115	46	5959	161

各比较结果

7 结果描述

处理效应。5 个同水平 R vs Y 比较的差异基因为 2,389–5,325 个、差异代谢物为 75–231 个，并随水平升高而增加：水平 1 为 2,798 个基因、75 个代谢物，水平 5 为 5,325 个基因、231 个代谢物。

水平效应。R 组内，水平 1–3 之间的差异基因只有 9（R1 vs R2）、3（R1 vs R3）、8（R2 vs R3）个，而涉及水平 4 或 5 的比较达到 1,058–5,456 个；Y 组内同样，水平 1–3 之间为 4、25、3 个，涉及水平 4 或 5 的为 499–2,378 个。R 组内的水平差异整体大于 Y 组内（R 组内最多 5,456 个，Y 组内最多 2,378 个）。

最大值。差异基因最多的是 R3_vs_Y5（6,801 个），差异代谢物最多的是 R4_vs_Y3（237 个）。代谢物差异数比基因少一到两个数量级，部分原因是代谢组只检测到约一千多个物质。

8 生物学意义

数据支持的观察

处理 R 与 Y 在每个水平都有大量差异，且差异总体随水平升高而扩大（差异代谢物从水平 1 到 5 逐级增加；差异基因在水平 2 略少于水平 1，水平 3 起明显增加），说明处理效应依赖水平（处理 × 水平交互）。同一处理内部，水平 1–3 的分子状态几乎相同，变化集中出现在水平 4、5，呈“阈值式”而不是逐级渐变的响应。两组学的差异规模在比较之间变化方向一致（规模散点图），说明转录和代谢对实验因素的响应是同步的。

需要进一步验证的假设

如果水平代表时间、发育阶段或处理强度，水平 3 到 4 之间可能存在一次生理状态的转变；R 组内变化更大，提示处理 R 下这一转变更强烈。这需要先确认水平的含义，再用更密的水平采样或生理指标验证。

9 局限性

代谢物 P 未做多重检验校正，与基因（padj）的标准不对等，差异代谢物中存在假阳性。每组只有 3 个重复，t 检验和 OPLS-DA 的稳定性有限。补算的 20 个比较 VIP 依赖模型，个别边界物质与服务商不同（见“数据与实验设计”页的复现核对表）。只在一组检出的代谢物 log2FC 是估算值。

参考文献

Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology, 2014, 15: 550.
Thévenot EA, Roux A, Xu Y, et al. Analysis of the human adult urinary metabolome variations with age, body mass index, and gender by implementing a comprehensive workflow for univariate and OPLS statistical analyses. Journal of Proteome Research, 2015, 14(8): 3322–3335.
Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B, 1995, 57(1): 289–300.