通路活性耦合：完整技术报告

1 分析目的

单个基因-代谢物配对噪声大、数量多。本分析把同一条 KEGG 通路的基因和代谢物各自汇总成一个“通路活性分数”，直接在通路层面看转录和代谢是否同涨同落（耦合）。如果某通路的基因活性与代谢物活性在样本间高度相关，提示该通路的转录变化可能反映在代谢产物上。

2 分析原理

1. 通路活性分数（pathway activity score）：每个分子 i 先在 30 个样本内做 z-score：

x_ij 为分子 i 在样本 j 的 log2 表达量（基因）或 log2 强度（代谢物），x̄_i、s_i 为它在 30 个样本中的均值和标准差。通路 p 在样本 j 的活性为通路内分子 z 值的算术平均：

基因层（A^G）、代谢层（A^M）分别计算，规则相同。方向：A>0 表示该样本中通路分子整体高于各自的 30 样本均值，A<0 表示整体偏低。分数不区分底物与产物、不区分正负调控、不加权，是“通路成员整体丰度水平”的粗略指标。

2. 耦合 r（30 样本）：r = Pearson(A^G_p, A^M_p)，30 个样本各一对值。选用 Pearson 的理由：活性分数是多个 z 值的平均，近似连续正态，关心的是线性同步；同时给出 Spearman 秩相关（r_spearman）作稳健性对照，两者接近说明结果不由个别离群样本驱动。P 值：把代谢层活性的样本标签随机打乱 1000 次，每次重算 r，P = (1 + |r_perm| ≥ |r_obs| 的次数)/(1 + 1000)（双侧）。FDR：对全部可评估通路的置换 P 做 BH 校正。

3. 组内耦合 r_within：两层活性各自减去所属组（10 组，每组 3 个样本）的组均值，再对残差求 Pearson 相关：

这是组内中心化方法，等价于以分组为协变量的偏相关；不是另做偏相关模型。P 值用组内置换：只在同一组的 3 个样本之间打乱代谢层活性（保持组结构不变），1000 次，双侧；同样做 BH 校正得到 fdr_within。

4. 两种耦合的区别：30 样本 r 包含两部分——组间（处理、水平导致两层均值一起变化）和组内（同组个体之间的随机差异是否同步）。如果 r 高而 r_within 接近 0，说明同步主要来自组间差异：两层都随实验因素变化，但不一定存在直接的物质流联系；如果 r_within 也高且显著，说明即使在同一处理水平下，基因活性高的样本代谢活性也高，是更强的耦合证据。

5. 单个比较的耦合：只取该比较的 6 个样本（两组各 3 个），用同一套活性分数计算 Pearson r。P 值为精确置换检验：枚举代谢层活性在 6 个样本间的全部 720 种排列，P = 满足 |r_perm| ≥ |r_obs| 的排列比例（含观测排列本身，最小可能值 1/720）；FDR 在该比较的全部可评估通路内 BH 校正。6 个样本分属两组，这个 r 主要反映两组均值的差异，不能与 30 样本 r 或组内 r 直接比较；每组只有 3 个样本，比较内不计算组内耦合。

6. 三种耦合的展示：耦合相关性热图把三类结果并列但分开：左侧 2 列为全部 30 个样本（总体 r、组内 r），右侧为各比较 6 个样本的 r，两部分之间留空并用色带标明样本集合。通路耦合网络为双层结构：左列为转录组通路节点（大小 = 有效基因数），右列为代谢组通路节点（大小 = 有效代谢物数），同一通路的两个节点之间的边表示耦合 r，红色为正、蓝色为负，粗细为 |r|；全局网络分“总体 r”和“组内 r”两套，比较组网络用 6 样本 r。网页上的交互网络可按 FDR、|r|、通路名称和有效样本量筛选。

3 输入数据及预处理

样本：30 个（全部通路都用满 30 个样本，n_samples 列给出实际数）。基因：表达过滤后的基因，log2(FPKM+1)。代谢物：全部有变异的代谢物，log2 强度，未检出记为 NA：该值不参与该物质均值和标准差的计算，也不参与该样本的通路平均，即 n_pj 为样本 j 中该通路已检出的代谢物数（数据表 n_met_min_per_sample 给出各样本中的最小值，n_met_with_missing 给出有未检出值的代谢物数）。作为敏感性分析，另用半最小值填补后的矩阵重算代谢层活性和耦合 r（r_imputed）。

纳入通路：KEGG 纳入通路中，基因层和代谢层各有至少 3 个分子的通路。分子数口径：n_gene 为通路内参与计算的去重基因数（表达过滤后），n_met 为通路内参与计算的去重代谢物数（有 KEGG 编号且有变异）；图中点大小为 n_gene + n_met。

4 软件、算法及参数

5 统计指标解释

下表列出本页出现的全部统计指标和缩写（由页面内容自动生成）。全部术语见术语表。

6 图表与结果展示

全局结果

目的

同时展示每条通路的 30 样本耦合和组内耦合。

坐标轴

横坐标为 30 样本耦合 r（Pearson），纵坐标为组内耦合 r_within；两轴范围 −1 到 1。

颜色

红=两种耦合都 FDR<0.05；浅红=只有 30 样本耦合 FDR<0.05；蓝=只有组内耦合 FDR<0.05；灰=都不显著。

点的形状与大小

点大小为参与计算的分子数（n_gene + n_met）。

图例

右侧。

显著性标记

FDR 来自置换检验（各 1000 次）后的 BH 校正；只标注至少一种耦合显著的通路名称。

数据筛选

基因层和代谢层各至少 3 个分子的通路。

样本与缺失值

30 个样本；代谢物未检出值不参与该样本的通路平均。

如何阅读

右上和左下象限为两种耦合同向；点靠右但纵坐标接近 0，说明耦合主要来自组间差异；同时靠右、靠上才是组内也成立的耦合。

目的

比较通路在基因层和代谢层的组均值活性。

坐标轴

行为通路（按耦合 r 从高到低），列为 G_ 开头的 10 组基因层活性和 M_ 开头的 10 组代谢层活性。

颜色

颜色为每行 z-score，色标 ±2。

点的形状与大小

无。

图例

右侧。

显著性标记

本图不标注显著性。

数据筛选

全部可评估通路。

样本与缺失值

活性计算时代谢物未检出值不参与。

如何阅读

同一行左右两半颜色模式相似，说明该通路两层活性随分组同步。

目的

并列比较每条通路在不同样本集合下的耦合 r。

坐标轴

行为通路（按 30 样本 r 从高到低），列分两部分：左 2 列为全部 30 个样本的总体 r 和组内 r，空一列后为 45 个比较各自 6 个样本的 r。

颜色

颜色为耦合 r，以 0 为中心，红正蓝负，色标 ±1。

点的形状与大小

无。

图例

右侧为色标；上方色带区分样本集合（深灰=全部 30 个样本，浅灰=单个比较 6 个样本）。

显著性标记

*、**、*** 为 FDR<0.05、0.01、0.001。总体 r 用全样本置换、组内 r 用组内置换（各 1000 次），6 样本 r 用 720 种精确置换；FDR 各自在全部可评估通路内 BH 校正。

数据筛选

全部可评估通路（两组学各至少 3 个分子）。

样本与缺失值

代谢物未检出值不参与计算（记为 NA）；30 样本部分每条通路都用满 30 个样本，比较部分每个比较 6 个样本。

如何阅读

三部分的样本集合和统计模型不同，只能各自看，不能把左侧的 r 和右侧的 r 当成同一种指标比较。某行右侧多数比较同色，说明该通路在多数比较中两层同向变化。

目的

把每条通路的转录组活性和代谢组活性画成两层节点，用边表示二者的耦合。

坐标轴

左列为转录组通路节点，右列为代谢组通路节点；同一行为同一条通路，按 r 从高到低排列。左面板为 30 样本总体 r，右面板为组内 r。

颜色

边：红色正耦合，蓝色负耦合；节点：蓝色圆形为转录组通路，橙色方形为代谢组通路。

点的形状与大小

边的粗细为 |r|；转录组节点大小为参与计算的有效基因数，代谢组节点大小为有效代谢物数。

图例

右侧依次为耦合方向、显著性、|r| 和节点大小。

显著性标记

实线（不透明）为 FDR<0.05，浅色为不显著；右侧数字为 r，* 表示 FDR<0.05。

数据筛选

全部可评估通路。

样本与缺失值

30 个样本；代谢物未检出值不参与计算（记为 NA）。

如何阅读

先看实线：左面板实线而右面板浅色，说明该通路的耦合来自组间差异，扣除分组后不再成立。

每条通路

各比较结果

7 结果描述

可评估通路。基因层和代谢层各有至少 3 个分子的通路共 62 条，每条通路都用满 30 个样本。代谢物端分子数中位数为 6（3–45），基因端中位数为 50。

30 样本耦合。FDR<0.05 的通路有 3 条：Indole alkaloid biosynthesis（r=-0.62）、Starch and sucrose metabolism（r=-0.62）、C5-Branched dibasic acid metabolism（r=0.63）。r 的绝对值都在 0.62–0.63，属中等强度。类黄酮生物合成的耦合 r=0.46（FDR=0.099），未达显著。

组内耦合。减去组均值后，所有通路的组内耦合都不显著（fdr_within 最小为 0.496）。上述显著通路的组内 r 分别为 -0.47、-0.29、0.23，组内置换 P 都 ≥0.081。

稳健性。显著通路的 Spearman 秩相关为 -0.54、-0.62、0.56，与 Pearson 结果同号且接近，不是由个别离群样本驱动。只有 7 条通路含有未检出值的代谢物，改用半最小值填补后 r 的最大变化为 0.095，未检出处理不影响结论。

单个比较（6 样本）。45 个比较 × 62 条通路中，精确置换 P<0.05 的有 160 个，比较内 FDR<0.05 的有 4 个，只出现在 R2_vs_Y4。6 个样本的精确置换最小 P 为 1/720，功效有限，单个比较的耦合只作描述。

8 生物学意义

9 局限性

活性分数把通路内全部分子等权平均，忽略了底物/产物、限速步骤和反馈抑制，正负方向相反的分子会互相抵消；分子数少的通路（3–5 个代谢物）分数波动大。组内只有 3 个样本，组内耦合的自由度低（约 19），检验功效有限，fdr_within 不显著不等于没有组内耦合。一条通路的分子可能同时属于其他通路，不同通路的活性分数不独立。代谢物端只覆盖有 KEGG 编号的物质。

参考文献

1. Tomfohr J, Lu J, Kepler TB. Pathway level analysis of gene expression using singular value decomposition. BMC Bioinformatics, 2005, 6: 225.
2. Lee E, Chuang HY, Kim JW, Ideker T, Lee D. Inferring pathway activity toward precise disease classification. PLoS Computational Biology, 2008, 4(11): e1000217.
3. Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B, 1995, 57(1): 289–300.